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本文报道了一种超小型线扫描非线性光学（ULSNLO）显微镜，其总体积比现有先进设计缩小了十二倍，这得益于首次将一维双色MEMS（微机电系统）扫描器与SiOB（硅光平台）组件集成。得益于创新的双色扫描结构，该ULSNLO显微镜的尺寸约为7mm x 6.5mm x 3mm，并实现了高达每秒数千帧的成像速度（受限于外部CMOS相机）。该设计将有望实现用于神经科学研究的自由行为动物头部佩戴式快速功能性神经元胞体成像。

一、介绍

在自由活动动物模型上实现细胞分辨率的功能性脑部光学成像，是现代神经科学研究中的热点。传统的动物脑部成像通常依赖大型台式显微镜，实验动物的头部需被固定于物镜下方进行观测。这无疑限制了动物的行为自由，并给动物带来不适与压力。

为应对这一挑战，研究人员已开发出多种适用于自由活动动物脑部成像的微型头戴式显微镜。首类技术是基于头戴式微型荧光显微镜的单光子成像技术，常被称为“微型显微镜”。这类设备利用GCaMP6等钙离子指示剂的优势，已成功应用于随时间编码多种记忆的CA1神经元集群成像。在微型显微镜中，集成的LED（发光二极管）提供大视场激发光照射样本，同时内置的彩色CMOS（互补金属氧化物半导体）相机采集发射出的荧光光子二维图像。然而，其宽场荧光显微成像原理限制了它对更细微结构与事件的成像分辨率；同时，由于采用可见光短波长，其在强散射脑组织中的穿透深度也仅限于数十微米。

为解决上述限制，多种微型化双光子显微镜被开发出来。利用近红外固态脉冲激光源的双光子显微镜，因其更佳的穿透深度和更少的光漂白效应，被认为是长期活体动物脑成像的理想工具。研究人员开发了首个基于光纤共振扫描的双光子头戴式显微镜。由于无法补偿的自相位调制效应导致脉冲展宽，且当时缺乏近期才出现的各类光子晶体光纤，该设计中使用单模光纤只能传输约1皮秒的激光脉冲。此外，驱动光纤振动的压电致动器速度较慢，导致采样率不足并产生明显的运动伪影。尽管改进了此设计，提升了成像速度并显著减轻了重量，但基于光纤扫描机制的微型化显微镜仍不适合稳定成像自由活动动物树突棘中的钙动态。这一结论同样适用于其他针状光纤扫描的非线性光学内窥镜或内窥显微镜，这些设备最初设计或宣称用于手持式活体或离体组织检查。

对于神经科学研究中迫切需要的快速成像，用以记录快速的神经元活动，MEMS（微机电系统）扫描器被证明是理想选择。研究人员构建了首台基于MEMS扫描器的便携式双光子显微镜用于活体脑成像。该设备采用定制的万向节式双轴静电微镜进行光栅扫描，其中一轴谐振，另一轴线性扫描。外壳选用碳纤维填充的PEEK（聚醚醚酮）材料，使显微镜重量仅为2.9克。2017年，研究人员展示了一种新型的基于MEMS扫描器的头戴式双光子显微镜，首次重点报道了其920纳米波长下的快速钙成像能力。新版设计的高性能得益于新发布的920纳米光子晶体光纤和市售的无万向节双轴微镜。尽管上述两种设计在激发激光传输光纤和MEMS扫描器上有所不同，但它们实际上共享了与传统大型台式双光子显微镜相同的光学架构，并使用相同的显微物镜供应商。

本文研究人员发现，若不简化现有显微镜架构，则难以进一步缩小目前已报道的基于MEMS扫描器的头戴式双光子显微镜的整体尺寸。为此，本文提出了一种全新的显微镜架构，即通过组合分色镜与扫描器实现“分色扫描显微镜”。采用分色MEMS扫描器这一通用概念（而非专指某款超小型非线性光学显微镜）已通过改装商用双轴微镜得到验证。

在超小型线扫描非线性光学显微镜中，我们定制了一款分色MEMS扫描器以替代广泛使用的反射式MEMS扫描器。因此，本设计移除了传统台式双光子显微镜中常见的扫描透镜、筒镜以及无限远校正物镜。与直接按比例缩小标准台式非线性光学显微镜的方案相比，本文报道的设计展现了更简洁的显微镜结构，从而实现了更小的尺寸和更优的成像性能。各微型头戴式显微镜的对比数据详见表1。

表1：微型头戴式显微镜性能对比。

二、设计、制造与初步表征

为实现快速成像以检测脑内钙荧光信号峰，我们采用绝缘体上硅工艺制造了一种基于静电梳齿驱动的一维分色MEMS扫描器，并将其集成于线扫描成像系统。通过激光切割定制了厚度为0.145毫米的薄型分色镜片，并将其一小片安装在一维MEMS扫描器的空心框架上，如图1所示。

图1：(a) 带可拆卸反射镜片的一维MEMS扫描器光学显微图像；一维MEMS扫描器扫描电镜显微图像：(b) 未安装镜片状态，(c) 安装切割后的分色镜片状态，(d) 安装镜片的局部放大视图。

如图2和图3所示，超小型线扫描非线性光学显微镜由以下部件构成：用于激发的光子晶体光纤、准直器、反射镜、用于形成线聚焦的柱面透镜、直径为0.8毫米的一维分色MEMS扫描器、微型物镜、重聚焦透镜以及成像光纤束。这些微型元件均经过精密对准，并组装在一块微加工制成的硅光平台上。

图2：(a) 超小型线扫描非线性光学显微镜示意图；(b) 显微镜在小鼠头部安装示意图；(c) 成像系统结构图。

图3：组装于硅光平台上的超小型线扫描非线性光学显微镜照片（未包含3D打印外壳及光纤）。

图4展示了微型物镜与重聚焦透镜的组合结构，该组合由一个高折射率半球透镜、一段按设计长度切割的梯度折射率透镜以及金属套管构成。定制微型物镜的工作距离约为0.2毫米，数值孔径为0.67。在我们的设计中，微型物镜与重聚焦透镜共同作用，等效于一个单一的Grintech微型物镜。分色MEMS扫描器被插入微型物镜的后焦平面，用于光束操控。

图4：(a) 微型物镜部件，包括高折射率半球透镜、梯度折射率透镜及金属套管；(b) 重聚焦透镜组装图；(c) 组装完成的重聚焦透镜特写视图。

硅光平台的制造始于一片4英寸、厚度为500微米的<100>晶向硅片。首先通过管式炉工艺生长3000埃厚的低压氮化硅层，作为后续硅湿法腐蚀的硬掩模。随后通过光刻工艺定义出用于元件对准的沟槽图案。经过2分钟的氮化硅干法刻蚀，露出即将进行湿法腐蚀的区域。

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采用各向异性硅湿法腐蚀在硅光平台上形成沟槽。硅片随后在120摄氏度下浸入N-甲基-2-吡咯烷酮溶液10分钟以去除光刻胶，接着在约40%的氢氧化钾溶液中腐蚀约3小时。湿法腐蚀完成后，测得沟槽深度为200±5微米。最后，将硅片上残留的氮化硅在氢氟酸中浸泡30分钟去除（图5a）。通过第二层掩模版定义出两条金属条带，以建立分色MEMS扫描器与外部驱动电路之间的电气连接。

图5：(a)硅湿法腐蚀后4英寸晶圆上的硅光平台，(b)组装完成的超小型线扫描非线性光学显微镜的俯视图与(c)侧视图。

采用基于数字光处理技术的立体光刻增材制造工艺，制作了一个具有五个表面的树脂外壳，以覆盖所有微型元件，其打印精度约为0.1毫米。图5b和图5c展示了组装在硅光平台上并配有3D打印外壳的超小型线扫描非线性光学显微镜照片。

一维分色MEMS扫描器的初步表征结果，包括频率响应和动态功耗，如图6和图7所示。该扫描器的谐振频率超过20千赫兹。在超小型线扫描非线性光学显微镜的线扫描模式下，这意味着其最大潜在帧率等于一维分色MEMS扫描器进行单向扫描的谐振频率，而实际成像速度的限制则取决于外部CMOS相机的成像速率。例如，一台高端的Andor Zyla 4.2 PLUS sCMOS相机在卷帘快门模式下，可实现128x128像素图像下1690帧/秒的成像。由于从聚焦区域发射的荧光光子会穿过分色MEMS扫描器，该检测为非去扫描方式，因此必须使用成像光纤束来传输二维扫描图像。受限于成像光纤束的分辨率，超小型线扫描非线性光学显微镜预计可对直径约10微米的神经元胞体提供高速成像能力。已通过CMOS相机的卷帘快门实现虚拟狭缝，并与一维分色MEMS扫描器同步，以形成二维图像。

图6：一维双色MEMS扫描器实测频率响应

图7：一维双色MEMS扫描器实测动态功耗。

三、结论

与近期报道的一款头戴式双光子显微镜相比，本文研发的超小型线扫描非线性光学显微镜整体尺寸约为7毫米 × 6.5毫米 × 3毫米，具备显著优势：总体积缩减至十二分之一（约136.5立方毫米对比约1600立方毫米），重量大幅减轻（0.25克对比2.15克），且成像速度显著提升（受相机限制可达数百至数千帧/秒，对比40帧/秒）。得益于其超紧凑尺寸，该超小型线扫描非线性光学显微镜有望实现在单个动物头部同时搭载多个（两个以上，最多可达四个）微型化双光子显微镜。

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