赛克数码

由悬浮状态下自组装肿瘤细胞构成的三维细胞培养模型，通常称为肿瘤球体，正成为高通量抗癌药物筛选的主流方法。筛选研究的一个常规可测量结果是肿瘤球体在治疗作用下的生长速率。这通常通过使用复杂昂贵的光学显微镜系统获得的图像进行量化，这些系统配备高质量光学元件和定制电子设备。本文提出一种新型便携式微型显微镜，它由低成本、可大规模生产的部件构成，能够生成荧光和相位梯度对比图像。由于相位梯度对比成像基于倾斜照明，该系统采用落射照明方式实现两种成像模式，从而简化了系统设计。研究人员描述了该系统的结构，通过合成样品表征其性能，并展示了系统的原理验证应用：在定制微流控装置内对肺癌和胰腺癌肿瘤球体的形成与生长过程进行成像和监测。

一、引言

自16世纪第一台科学显微镜问世以来，显微镜随着光学元件校正技术的不断进步与照明策略的持续优化而发展，从而获得更明亮、更清晰且无伪影的图像。上世纪以来，图像采集设备与集成控制电子元件的应用开启了显微镜的数字时代，实现了显微镜系统的自动化，并引入数字信号处理技术对电子采集图像进行分析。近年来，新型工程方案被提出，能够人为"突破"成像过程物理规律所设定的衍射极限，将显微镜的分辨能力提升至数十纳米量级。与此同时，遵循"自主制造"理念，越来越多针对特定应用定制的自制显微镜系统得以开发。这类自主制造显微镜系统普遍具备便携性、低成本及针对特定应用可定制化的特点。其中部分系统通过技术社区的协作模式开发，允许多位技术人员参与设计，并提供公开详尽的搭建步骤说明及高水平技术支持。典型案例包括用于自由活动小鼠脑部活动研究的微型荧光显微镜Miniscope、具备无线功能的微型显微镜Wireless平台，以及用于三维样本介观观察的光片显微镜OpenSpim。此外，其他实验室还开发了涵盖相干反斯托克斯拉曼散射、傅里叶叠层显微术及单光纤显微术等多种技术的自制设备。

在癌症生物学领域，旨在弥合传统体外与体内模型生理差距的三维细胞培养模型正受到日益广泛的关注。过去十年间，球体（即悬浮状态的三维细胞聚集体）已被引入组织建模与疾病（包括癌症）研究领域。生成这些球体可采用多种策略，其中微流控技术的应用尤为突出。微流控平台不仅能够对球体微环境实现高精度控制和便捷操控，其微观尺寸与实验集成特性还大幅减少了试剂消耗量，从而有效降低了实验成本。

配备高质量光学与电子元件的通用显微镜通常被用于肿瘤球体的体内生长追踪，这类系统对于相对简单的成像任务而言存在功能冗余。市场上虽存在少量商用专用系统，但其价格昂贵且主要设计用于在较大支撑系统（如多孔板）上追踪三维培养物。本文介绍的Spheroscope是一种新型微型倒置显微镜，专为微流控平台中肿瘤球体的形成与生长过程成像追踪而设计，兼具落射荧光成像与基于倾斜背向散射照明的落射照明相位梯度对比成像功能。该设备最初由研究人员依据自主制造理念设计，采用低成本梯度折射率透镜、微型光学元件和通用电子元件构建，但其分辨率、灵敏度及无像差视场性能使其适用于活细胞样本的中低分辨率长期成像。本文将详细阐述系统组成元件，定量表征其性能，并通过在定制微流控装置内对肺癌与胰腺癌细胞系三维肿瘤球体的形成生长过程进行二维图像监测的原理验证，展示该系统的实际应用能力。

二、结果

01.Spheroscope系统实现与性能表征

Spheroscope的光学设计（图1）灵感来源于研究人员分别提出的荧光成像与倾斜背向散射照明方案，通过整合优化形成简洁的一体化结构，并根据实际应用需求调整了工作距离与视场参数。该系统外壳采用铝合金材质，尺寸为7×9×7.2厘米，重量375克，内部集成了所有光学与电子组件。按单件采购计算，其元器件成本约为2500欧元，若进行规模化量产则可大幅降低费用。

图1.Spheroscope设计与实现 (a) 显微镜设计分解示意图，主要元件标注如下：(1) CMOS传感器；(2) 消色差透镜；(3) 发射滤光片；(4) 二向色镜；(5) 物镜梯度折射率透镜；(6) 光纤电缆；(7) 光阑；(8) 激发滤光片；(9) 扩散透镜；(10) 聚光透镜；(11) 蓝色LED。 (b) Spheroscope原型机实物图。 (c) 配备微定位平台的Spheroscope系统。

该系统的照明与图像采集光路如图2所示，具体说明如下：

图2.Spheroscope照明与图像采集光路示意图 (a) 落射照明光路 (b) 倾斜背向散射照明光路 (c) 图像采集光路

0101.照明系统

落射荧光照明（图2a）采用带散热片的蓝色LXML-PB01-0040 LED光源。通过焦距8毫米的聚光透镜ACL12708U-A，光线依次经过扩散透镜DG05-600、激发滤光片BP470/35以及用于阻挡离轴光线的4.25毫米孔径光阑。与光路呈45度角放置的二向色镜FF495-Di03将光线反射至物镜，最终聚焦于样本。

香港星云先进技术有限公司（NAT）是Grintech亚洲代理商，我们为客户提供梯度折射率透镜（GRIN透镜）等光学产品。

倾斜背向散射照明（图2b）使用两个绿色M530F2 LED光源，各通过定制光纤FT400EMT将光线传导至物镜两侧，以可调距离和入射角照射样本。

0102.图像采集系统

物镜由两个垂直堆叠的梯度折射率透镜构成。第一片GT-IFRL-200-001-50-NC透镜（Grintech公司）收集来自样本（位于透镜前表面1毫米处的焦平面）的光线，在透镜后表面形成样本图像。第二片工作距离为0毫米的GT-IFRL-200-inf-50-NC透镜（Grintech公司）收集前一片透镜后表面的图像，并将其以平行光束形式投射至无限远。这些无限远光线穿过二向色镜与发射滤光片FF01-525/45后，由焦距19.1毫米的消色差双合透镜SN49-759汇聚并聚焦至显微镜CMOS传感器daA2500-14um裸片（图2c）。通过USB 3.0接口配合Basler默认软件Pylon Viewer控制传感器。系统分辨率、放大倍率、视场和工作距离由首片梯度折射率透镜与消色差透镜共同决定，消色差透镜与CMOS传感器之间的间距可通过调节轮调整，从而适配不同焦距的消色差透镜。

该CMOS传感器具备500万像素（像元尺寸2.2×2.2微米），感光区域5.7×4.2平方毫米。采集图像尺寸为2592×1944像素，位深14位。荧光模式采集的图像无需后处理。

相位梯度对比成像基于研究人员提出的倾斜背向照明显微技术原理实现。通过两个径向对称的离轴光源交替照明样本，采集两幅图像并进行合成，最终生成相位梯度对比图像。

分别表示经过高斯滤波（σ=100像素）处理的图像版本。如研究人员所述，采用1/2系数旨在使最终相位梯度对比图像的数值表示相对于背景的百分比偏差。对相位梯度对比图像进行中值滤波（卷积核尺寸3×3）以消除噪声，并通过偏移所有像素值（偏移量为图像中最负像素值的绝对值）处理负值。为便于显示，图像经灰度映射对比度拉伸至0（黑）至255（白）范围，示例如图3所示。

图3.倾斜背向散射照明图像重建示例。 加载于微流控装置中的H1299细胞 (a) 右侧LED照明获取的原始图像 (b) 左侧LED照明获取的原始图像 (c) 重建后的倾斜背向散射照明图像 比例尺标示长度为50微米

0103.性能表征

对Spheroscope在倾斜背向散射照明与落射荧光照明模式下的性能进行了系统表征。通过校准玻片在倾斜背向散射照明模式下测量了与成像模式无关的系统放大倍率及有效视场。需说明的是，由于校准玻片仅呈现二维印刷结构而无深度信息，相位梯度对比图像几乎不显示有效信息，因此采用吸收信息替代相位信息获取校准玻片图像（将公式1中的减号替换为加号）。系统分辨率根据梯度折射率透镜的数值孔径计算得出。检测灵敏度通过含校准微珠玻片的落射荧光图像进行测量。最后，通过计算20微米聚甲基丙烯酸甲酯荧光微珠在相位梯度对比与荧光双模式成像中的检测准确率，完成对系统两种成像模式的综合验证。

系统放大倍率采用图4a所示10微米间距校准网格进行测定。中心区域连续十个网格单元（对应实际距离100微米）在CMOS传感器采集图像中占据404像素。根据传感器像元尺寸（2.2微米）折算，该距离对应投影长度888微米。由此计算得Spheroscope系统放大倍率为888微米/100微米=8.88倍。

图4.Spheroscope性能表征图示 (a) 用于计算放大倍率的10微米网格；(b) 根据图(a)网格局部方差计算得到的平场分布图，红色实线标示平场区域，红色虚线框显示有效视场范围；(c) 用于计算无像差区域的同心圆图案，该图案在图像视场中按九个坐标位置居中显示（从左至右、从上至下依次为）：(345,1614)；(1374,1614)；(2268,1614)；(345,1039)；(1374,1039)；(2268,1039)；(345,264)；(1374,264)；(2268,264)像素坐标；(d) 根据分布在整个图像视场内等间距排列的同心圆图案偏心率计算所得的像差分布图，红色实线标示无像差区域，红色虚线框显示有效视场范围；(e) Spheroscope采集的20微米校准微珠相位梯度对比图像，显示有效视场内微珠分割轮廓；(f) Spheroscope采集的20微米校准微珠荧光图像，显示系统有效视场内微珠分割结果；(g) 通过倾斜背向散射照明与荧光图像测得的微珠平均直径，绿色实线代表制造商提供的直径平均值参考线，绿色虚线代表标准偏差参考线。注：比例尺标示长度为50微米。

Spheroscope的有效视场范围通过计算系统平场与像差场确定。一方面，利用图4a所示的10微米间距校准网格，通过测量网格线在整个图像中的聚焦程度来量化场曲，具体采用局部方差法进行计算（公式2）：

Spheroscope的有效视场通过系统平场与像差场的综合分析确定。首先，利用图4a所示的10微米间距校准网格，通过计算图像各区域网格线的聚焦程度来评估场曲，具体采用局部方差法（公式2）进行量化。其中M与N分别代表计算窗口的像素长度与宽度（本研究采用200×200像素窗口），u(i, j)表示窗口内坐标为(i, j)的像素强度，ū为窗口像素平均强度。通过对图4a全图像进行200×200滑动窗口方差计算，得到场曲分布图如图4b所示。

另一方面，使用图4c所示含同心圆图案的校准玻片，通过测量均匀分布于视场内同心圆图案的偏心率绘制像差分布图。具体方法为：采集同心圆图案在x与y方向每间隔52微米平移后的88幅图像（构成8行11列网格），将这些图像合成为单幅合成图像。图4c展示了传感器成像区域内九个代表性位置的同心圆图案局部重建图像。采用Fiji图像处理插件序列对图案外圆进行分割：首先使用“滚动球背景扣除”插件（结构元素半径20像素），随后采用“大津阈值分割”算法，最后通过3×3卷积核中值滤波去除噪声。根据分割区域测量圆形的偏心率，并通过线性插值将离散测量值转换为连续像差分布图（图4d）。

Spheroscope的有效视场定义为平场区域（图4b中方差偏离度低于50%的区域）与无像差区域（图4d中偏心率偏离完美圆形低于30%的区域）的交集。该交集区域构成1024×1024像素的有效视场（图4b,d中红色虚线框），对应传感器2.25×2.25平方毫米区域或样本254×254平方微米区域。

根据阿贝衍射定律，系统横向分辨率计算公式为成像光波长(λ)与两倍物镜数值孔径(NA)的比值。荧光模式下激发LED波长470纳米，梯度折射率透镜数值孔径0.6，理论横向分辨率为470纳米/1.2=391纳米；倾斜背向散射照明模式下激发LED波长530纳米，相同数值孔径下理论横向分辨率为530纳米/1.2=441纳米。

采用Sphero GFP校准微珠试剂盒进行荧光模式灵敏度测定。该试剂盒包含直径3.0−3.4微米的荧光微珠（激发波长489纳米，发射波长510纳米），具有六个递增的荧光强度等级（PEAK 1-6级），以归一化平均荧光强度值表征。各级MEF值分别为：PEAK 1:0.42，PEAK 2:2.751，PEAK 3:11.914，PEAK 4:130.96，PEAK 5:317.386，PEAK 6:621.248。

首先测定系统信噪比变化规律：每个PEAK等级制备7组微珠玻片，通过调节LED强度（50%最大功率下曝光时间250-1000毫秒阶梯变化；固定曝光500毫秒下调节LED强度为25%、75%、100%）建立7种实验条件。根据LED规格书，25%、50%、75%、100%强度分别对应30.75流明、51.25流明、73.8流明、90.2流明光通量。每种条件采集7幅图像，经背景扣除、大津阈值分割、中值滤波、二值分水岭处理后，通过尺寸阈值筛选（100-450像素）获得独立微珠掩模。

微珠强度测量采用3×3方形结构元素腐蚀掩模后计算剩余像素均值；背景强度通过两次膨胀掩模后取反计算区域平均值。信噪比计算公式为SNR=C/σB（C为微珠平均强度，σB为背景标准差）。如图5i-j所示，检测下限为PEAK3级别。依据Albert Rose准则（SNR>5时可实现有效分割），在500毫秒曝光条件下：PEAK4检测需LED强度≥75%，PEAK5需≥38%，PEAK6在20%强度下即可检测；在50%LED强度下，PEAK4、PEAK5、PEAK6分别需要≥700毫秒、≥350毫秒、≥200毫秒曝光时间。

图5.使用不同归一化强度微珠的灵敏度研究

(a,d) PEAK 4级别微珠图像（曝光时间：1000毫秒；LED强度：50%）

(b,e) PEAK 5级别微珠图像

(c,f) PEAK 6级别微珠图像

(a–c) 原始图像

(d–f) 分割结果

比例尺标示长度为50微米

(g) 信噪比随LED强度变化曲线（曝光时间：500毫秒）

(h) 信噪比随曝光时间变化曲线（LED强度：50%）

(i) Spheroscope测得的PEAK 4、PEAK 5、PEAK 6微珠强度值，绿色星号代表各PEAK级别的理论强度值

随后通过测量各PEAK级别间的相对强度，验证Spheroscope能否复现制造商报告的理论差异。将PEAK 4、5、6级别微珠分散于标准显微镜载玻片，每个玻片采集八幅图像（图5）。按照前述方法处理图像后，计算各PEAK组别的微珠强度中位数与四分位分布（图5g）。结果显示测量强度值与理论值高度吻合（图5g中绿色星号标示）。

综上所述，在较宽的强度与曝光时间参数范围内，Spheroscope能够有效检测PEAK3以上级别的荧光微珠。实际应用中需根据具体需求在可用参数范围内进行平衡设置，综合考虑采集时间限制、荧光染料光漂白效应以及光照对细胞的潜在光毒性等因素。

最后，通过分析校准微珠在Spheroscope图像中的尺寸测量结果（图4e,f），综合评估系统在荧光与相位梯度（倾斜背向散射照明）双模式下的成像质量。使用20微米聚甲基丙烯酸甲酯荧光微珠（激发波长450–565纳米，发射波长540-620纳米），将其分散于标准载玻片后，分别用荧光和相位梯度模式各采集五幅图像。随后通过以下方法对显微镜有效视场内的微珠进行分割分析：

荧光模式下，先对图像进行对比度受限的自适应直方图均衡化处理，再通过Matlab的“imfindcircles”函数（限定在有效视场内）检测所有微珠。该函数在给定半径范围内通过最大化图像的霍夫变换对比度实现检测。相位梯度对比图像则采用自主研发的算法处理：所有微珠边缘均呈现对称分布的黑白像素区域（图4e），算法从微珠中心像素出发径向搜索最暗（p1）与最亮（p2）像素区域，p1与p2间的距离即对应球体直径。共计处理348个微珠样本。

图4e,f分别展示了相位梯度对比与荧光模式下的分割示例。两种模式测量结果的对比显示于图4g：相位梯度对比图像测得的微珠平均直径（20.21±2.54微米）与荧光图像测量值（20.34±1.13微米）无统计学差异，且两者均与制造商提供的标准值（20.23±1.31微米）高度吻合。

02.实验结果

0201.器件设计与制备

微流控装置采用三层结构设计（图6a）。顶层与中层由聚二甲基硅氧烷制成，底层采用商用盖玻片以增强刚性并便于实验操作。顶层覆盖微流通道并设有装置的进样口与出样口。中层包含微流控图案，设计有7行42个250×250×250微米立方微室，各微室通过顶部设置的250×100微米通道相互连接。图6b展示了连接进样管的微流控装置实物图。

图6.微流控装置与流动模拟

(a) 微流控装置结构示意图

(b) 制备完成的微流控装置实物图

(c) 流速0.5微升/分钟条件下单个微室入口处的流体速度剖面与流线模拟图

(d) 直径10微米颗粒在0.5微升/分钟流速下的三维运动轨迹模拟

0202.装置加载流程

将培养基中的细胞悬浮液通过微装置进样口注入。根据流动模拟结果（图6c,d），在0.5微升/分钟的加载流速下，细胞运动速度足够缓慢，可确保细胞在重力作用下沉降进入微室。细胞被捕获于微室后，装置表面经过抗粘附处理可防止细胞黏附至室壁或底部。因此，缺乏合适附着基底的细胞会相互聚集，最终形成球体结构。

0203.实验一：球体尺寸对比分析

为评估Spheroscope与商用显微镜的成像质量差异，在微流控装置内培养113个肿瘤球体，分别使用Spheroscope的相位梯度对比模式和配备N-Achroplan 10×0.2NA物镜与Axiocam MRm相机的蔡司Cell Observer商用显微镜（相位对比模式）进行成像。具体方法：将胰腺导管腺癌细胞系PDAC93 KRAS P53H PTF1-CREKI的小鼠细胞按上述流程加载至微流控装置，在培养箱中维持48小时直至球体形成。随后对同一组113个球体进行双系统成像，并通过定制Fiji宏脚本进行人工分割，根据分割掩模测量面积。针对每个球体，定义系统间差异为较小分割面积与较大分割面积的比值。结果显示，分割面积的平均差异率为5%（图7）。

图7.显微镜系统对比

(a,b) 使用配备N-Achroplan 10×0.2NA物镜与Axiocam MRm相机的蔡司Cell Observer显微镜获取图像中单个球体的人工分割结果

(c,d) 使用Spheroscope获取的同一球体图像人工分割结果

(e) 展示113个球体在两种系统成像下人工分割面积差异率的箱形图

比例尺标示长度为50微米

0204.实验二：肿瘤球体形成与动态追踪

为验证Spheroscope监测肿瘤球体形成过程的能力，使用该系统对非小细胞肺癌细胞系H1299-GFP形成的球体进行追踪。将H1299-GFP肺癌细胞按上述方案加载至微流控装置，在加载后0、5、24和48小时的时间点对14个样本进行荧光与相位梯度（倾斜背向散射照明）延时成像。图8展示了球体在倾斜背向散射照明模式（a-d）与荧光模式（e-h）下的形成与演化过程。通过Fiji定制宏脚本对图像中球体进行人工分割并测量其占据面积，进而评估球体形成动态。图8m显示：实验初始阶段（0至5小时）细胞团面积快速减小，此时细胞发生聚集并形成球体结构；随后球体尺寸保持相对稳定。

图8.Spheroscope记录的球体48小时形成演化过程图像

(a–d) 倾斜背向散射照明模式图像

(e–h) 荧光模式图像

(i–l) 双模式融合图像（依次对应0小时(a,e,i)、5小时(b,f,j)、24小时(c,g,k)、48小时(d,h,l)时间点）

(m) 展示细胞聚集趋势的定量分析图

比例尺标示长度为50微米

最后，对培养终点获取的球体图像进行了Spheroscope与商用蔡司Cell Observer显微镜的对比分析。图9展示了两组对比图像系列。根据获得的数据，我们得出结论：在此分辨率水平下，Spheroscope在荧光模式与明场模式下的成像质量均与商用显微镜相当。

图9.Spheroscope与配备N-Achroplan 10×0.2NA物镜及Axiocam MRm相机的蔡司Cell Observer显微镜对比图序列。两组图像展示同一球体在0小时(a,e)、5小时(b,f)、24小时(c,g)及48小时(d,h)的发育状态：

(a–d) Spheroscope采集图像（倾斜背向散射照明与落射荧光融合）

(e–h) 蔡司Cell Observer显微镜采集图像（透射明场与落射荧光融合）

比例尺标示长度为50微米。

三、讨论

高通量体外分析正逐渐成为验证抗癌药物疗效的主流方法。传统研究多采用标准二维细胞培养模型，但其生理状态无法真实反映体内癌细胞的生存环境。近年来，能够提供更贴近生理环境的新型三维细胞模型得到日益广泛的应用。在这些模型中测得的药物效应，更能代表药物对患者的潜在疗效。特别是由悬浮细胞簇形成的肿瘤球体，作为基础三维结构，相较于标准二维培养细胞能更有效地用于抗癌药物研究。

通常采用球体生长速率等简单指标来量化药物效应，但其测量却依赖配备高质量光学元件与控制电子系统的复杂昂贵设备。此外，相关研究多在尺寸较大、结构固定的多孔板中进行，导致试剂成本高昂且实验灵活性不足。

本文提出的Spheroscope是一种遵循自主制造理念定制的低分辨率明场与荧光显微镜。研究表明，该系统虽采用低成本组件，却能成功对分离的肺癌细胞在定制微流控平台内以高通量模式培养形成的三维球体进行成像，并监测其形成与生长过程。我们详细阐述了Spheroscope原型机的设计与制造方案，并系统表征了其性能参数：有效视场、放大倍率、分辨率及灵敏度均能满足肿瘤球体高效成像及其48小时内发育与活性研究的需求。

未来工作将致力于系统工业化改造，实现载物台自动化并构建恒温培养环境，从而在大量微室中实现球体生长的高通量监测。该工业化设备将配套开发控制软件并集成基础图像分析工具。

四、材料与方法

01.细胞与细胞培养

非小细胞肺癌细胞系H1299购自美国模式培养物集存库。该细胞系通过稳定转染表达绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP-C1载体构建。胰腺导管腺癌细胞系PDAC93 KRAS P53H PTF1-CREKI源自小鼠模型胰腺肿瘤组织，由应用医学研究中心的研究人员惠赠。

H1299-GFP细胞使用添加10%胎牛血清与1%青霉素-链霉素双抗溶液的RPMI 1640培养基培养。胰腺细胞采用相同配方培养，仅将RPMI 1640替换为DMEM基础培养基。细胞在37°C、5%二氧化碳条件下培养，每48小时在培养瓶中进行传代以维持适宜增殖环境。实验前通过牛鲍氏计数板测定细胞浓度，典型浓度为每毫升100万个细胞。

02.微流控器件制备

聚二甲基硅氧烷层采用标准复制模塑法制备，使用两种不同模具。中间（图案化）层模具通过传统光刻技术在硅片上制作SU8光刻胶凸起结构。顶层模具采用光固化三维打印机制作。将聚二甲基硅氧烷基体与固化剂按1:10体积比混合后注入模具，真空脱气30分钟。为满足倾斜背向散射照明成像需求，在聚二甲基硅氧烷混合液中加入白色丙烯酸涂料（体积比1:50）使顶层具备遮光性，随后在70°C固化4小时。

鉴于Spheroscope工作距离仅1毫米，需尽量减少底层聚二甲基硅氧烷厚度。为此在硅片周围构建500微米高的围堰结构，注入脱气后的聚二甲基硅氧烷混合液后，覆盖经硅烷化处理的平整玻璃片，通过围堰控制形成500微米厚聚二甲基硅氧烷层。

脱模后，两层聚二甲基硅氧烷通过40瓦氧等离子体处理30秒实现永久键合，相同工艺重复用于盖玻片与聚二甲基硅氧烷组件的键合。最后将微流控器件置于70°C烘箱中加热1小时以上以增强键合强度。

03.表面处理

细胞加载前24小时需进行表面处理以防止细胞黏附至微室与通道内壁。将1%体积比的表面活性剂溶液通过22号套管连接的聚四氟乙烯管手动注入通道，在装置内静置至少4小时。此期间采用紫外交联仪对装置进行至少2小时紫外灭菌。细胞加载前用培养基从进样口冲除表面活性剂溶液。

04.球体形成与成像

器件准备完成后，使用注射泵以每毫升100万个细胞的浓度注入细胞悬浮液。为确定最佳流速，采用多物理场仿真软件进行流体模拟以选定初始工作流速范围。模拟主要目标是确定流速阈值范围，使得位于流体下流线的细胞能通过重力作用沉降至微室。仿真结果验证了细胞在所有微室中的分布状态。细胞沉降后，在球体形成过程的0、5、24、48小时对每个微室采集两幅图像：相位梯度对比图像曝光时间500毫秒；荧光图像采用50%LED强度及500毫秒曝光时间。商用落射荧光显微镜采用相同时间点进行图像采集。

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