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尽管活体显微技术对于研究完整哺乳动物大脑的神经元结构与功能至关重要，但传统的活体显微技术通常局限于嗅球、新皮层或小脑皮层等浅表脑区。为了对更深层区域的细胞进行成像，本文讨论了使用可植入组织的梯度折射率显微透镜进行活体光学显微内窥镜检查的方法。研究人员的一般方法广泛应用于大脑深部及身体的许多区域。显微内窥镜具有多种光学设计，可实现不同空间尺度的成像，其空间分辨率现已接近标准水浸显微镜物镜的水平。将显微内窥镜探头集成到便携式微型显微镜中，可在自由活动的动物身上进行成像。结合丰富的荧光标记物、动物模型以及转基因小鼠，显微内窥镜方法能够实现精密的实验设计，用以探究在健康动物和疾病动物模型中，细胞特性如何构成或反映动物行为及生活经验。

一、研究背景

近期，活体光学显微镜技术的重大进展为研究完整哺乳动物大脑中的神经元结构和动态提供了开创性手段。在清醒但头部固定的动物中应用双光子显微镜，甚至可以在动物主动行为期间进行钙成像研究。然而，光子散射限制了光学显微镜对组织的穿透深度，使传统活体显微镜技术仅适用于嗅球、新皮层和小脑皮层等浅表组织区域。采用落射荧光显微镜时，穿透深度通常限于50至100微米；而传统双光子显微镜的穿透深度约为500至700微米。

为提升显微镜对组织的穿透深度，近年来一系列创新光学策略已通过实验探索。本文介绍其中一种方法：光学显微内窥镜技术。该技术通过使用针状微光学探头，能在这些方法中穿透最深的组织，达到超过1厘米的深度。这些探头通常起到光学中继的作用，可被植入组织内部。根据下文讨论的光学限制条件，探头长度可根据待检组织的解剖深度进行定制。

光学显微内窥镜提供的空间分辨率可接近传统水浸物镜的水平；兼容多种对比模式，包括落射荧光、双光子激发荧光和二次谐波生成；并已应用于活体小鼠和人体研究中。本文阐述了选择显微内窥镜探头时的光学考量因素，以及对直立式光学显微镜的改进以适配显微内窥技术。有关在完整哺乳动物大脑中成像细胞特性的方法，可参阅《海马体活体显微内窥镜技术》一文。该技术同样兼容基于微光学设计的便携式微型显微镜，可在自由活动的小鼠身上实现成像功能。

图1 活体光学显微内窥镜方法。（A）经改造的直立显微镜光路示意图，可同时实现单光子和双光子荧光显微内窥成像。在双光子成像模式下，超短脉冲红外钛宝石激光器的光束在显微镜物镜焦平面内进行扫描。通过调节物镜与显微内窥镜之间的轴向间距，显微镜物镜的焦平面被同步设定为显微内窥镜的后焦平面。另一调焦机制用于同步降低物镜与显微内窥镜朝向动物的位置。在单光子成像模式下，汞弧灯提供照明。两种成像模式中，荧光发射信号均通过显微内窥镜返回，分别由相机或光电倍增管接收用于单光子或双光子成像。（B）0.5毫米直径双合透镜设计显微内窥镜尖端与0.8毫米外径玻璃毛细导管的实物照片，该显微内窥镜可插入导管中。显微内窥镜的中继部分为黑色涂层。导管尖端附有玻璃盖玻片，该导管设计便于快速更换显微内窥镜而不扰动下方组织。比例尺：1毫米。（C）显微镜物镜与显微内窥镜探头安装于级联调焦驱动器上，提供双焦点调节功能。该装置允许物镜单独移动或与显微内窥镜同步移动。显微内窥镜还可摆动移出光轴，以进行常规显微镜观察。（D）单片梯度折射率透镜型、平凸复合梯度折射率透镜型及双合梯度折射率透镜型示例显微内窥镜的光线追踪图。比例尺：1毫米。

二、成像系统配置

01.显微镜主体

几乎所有配备无限远光学系统且已适用于活体成像的直立显微镜均可直接用于显微内窥镜技术。固定显微内窥镜探头主要有两种方式，其中一种需要对显微镜进行定制化改造。

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在较简单的方案中，显微内窥镜探头通过植入实验动物体内固定，而非机械连接至显微镜主体。当动物与探头位置正确时，显微内窥镜将显微镜物镜的焦平面中继至深层组织，其缩放比例取决于探头的具体光学设计。此方法的优点在于无需对显微镜进行任何改动，但缺点是探头相对于组织的细微调整无法自动与光轴对齐。

另一种方案将显微内窥镜探头安装于显微镜调焦装置上，并对其进行改造以实现两种精细调焦模式。第一种模式调节显微镜物镜相对于显微内窥镜探头的位置；第二种模式使物镜与探头联动移动，从而在植入组织时不影响其与物镜的光学耦合。两种模式均可实现电动化控制。为夹持探头侧面，研究人员采用双爪夹持器固定于微型探头夹具上，该夹具可沿长轴旋转并摆动进出光路。通过调节夹具的两个旋转自由度，可使显微内窥镜与光轴精确对准。物镜轴向位置的调整通过安装于显微镜物镜转换器上的步进电机实现，此时保持探头固定，通过改变照明在微透镜上方的聚焦平面来调节样本焦平面。探头与物镜的联动移动则通过显微镜常规调焦驱动器完成。

02.显微内窥镜探头

显微内窥镜探头可根据具体应用进行定制，不同场景下需优先选择不同的核心光学参数。例如，某些光学设计更适合观察树突等亚细胞结构，而另一些设计则更适用于神经元动态的宽场钙成像。目前主要有三类光学设计：第一种采用单片梯度折射率透镜，提供低放大率与大视场；第二种将梯度折射率透镜与高数值孔径平凸微透镜串联组合，能实现更佳的光采集效率与衍射极限分辨率，但视场较小；第三种采用梯度折射率中继透镜耦合梯度折射率物镜的设计，允许探头长度超过5毫米并具有中等尺寸视场。

这三类探头均可理解为由两个串联光学元件构成：一个将照明聚焦至样本并收集发射光子的无限远微物镜，以及一个接收显微镜聚焦照明同时将样本发射光聚焦至直立显微镜物镜前焦平面的微光学中继透镜。在单片梯度折射率透镜中，两种功能由单一光学元件实现；而在复合梯度折射率探头或高分辨率探头中，物镜与中继功能由两个串联的微光学元件分别完成。在落射荧光显微内窥术中，中继微透镜将样本实像投射至显微镜物镜焦平面。表1展示了三类代表性显微内窥镜的光学参数，具体设计公式可参考相关文献，研究人员可根据定制需求设计探头并进行商业化制备。

表1 示例显微内窥镜探头特性

03.显微内窥镜直径

显微内窥镜探头直径范围从0.35毫米至2.8毫米均有市售产品（例如Grintech公司提供），研究人员实验室最常使用0.35毫米、0.5毫米和1.0毫米规格。在相同数值孔径条件下，较小直径探头（如0.35或0.5毫米）能提供与较宽直径探头相当的分辨率和放大倍数。然而相同数值孔径下，较宽的探头通常具有更长的工作距离和更广阔的视场。此外较小直径探头更为脆弱，采用薄壁不锈钢套管封装可增强其结构强度。直径仅0.35毫米的探头已成功应用于包括人体在内的高分辨率活体激光扫描成像领域。

04.显微内窥镜长度

探头长度通常根据被检组织深度及手术制备的机械限制进行设计。其长度需足以将组织深层样本平面的光子传导至无障碍的中间焦平面，该平面亦为显微镜物镜的焦平面。在需对深部组织成像的应用中，通常通过调整中继微透镜的长度来实现。

中继微透镜的有效长度计算需首先确定其玻璃梯度折射率基底的光学节距。在近轴近似下，光线沿显微内窥镜光轴传播时，其径向距离随轴向传播距离呈正弦曲线变化。一个节距长度定义为光线完成完整正弦周期的基底长度，该长度取决于梯度折射率材料径向变化的折射率分布。此类材料的圆柱棒可按节距长度单位切割成不同长度：整数或半整数节距透镜可将透镜一侧焦点发出的光线重聚焦至另一侧焦点；而四分之一节距透镜及其奇数倍节距透镜则为无限远透镜，可将进入微透镜一侧的准直光线聚焦至对侧焦点。更长的显微内窥镜探头可通过给中继透镜叠加多个半节距长度来设计，这种延伸不会改变数值孔径、放大倍率、视场或工作距离，但过长探头常因球面像差累积导致光学分辨率下降。

05.样本光学工作距离

梯度折射率物镜的工作距离由其设计长度略短于四分之一节距的程度决定。较短节距的物镜具有较长工作距离，但其数值孔径会降低。典型工作距离范围在0微米至800微米之间。在单光子荧光成像中，光散射限制有效成像范围不超过内窥镜尖端约100微米，因此工作距离相对较短。而在双光子成像中，显微内窥镜可对超出探头尖端约650微米的组织进行成像，通常需要设计更长的工作距离。

虽然焦平面可调整至不同于工作距离的深度，但显微内窥镜通常在指定工作距离处具有最小光学像差。特别是高分辨率梯度折射率与平凸复合透镜，通过选择梯度折射率中继透镜的径向折射率分布，可在特定工作距离补偿物镜组件的像差。因此高分辨率实验应将目标组织置于设计工作距离处。但对于可接受适度分辨率下降的成像实验，将光学工作距离设计比实验所需长数百微米更为便利，这能确保双光子成像的激光扫描平面或单光子成像的中间实像不位于显微内窥镜外部玻璃表面，避免表面缺陷影响图像质量。

06.与显微内窥镜探头光学耦合的显微镜物镜

0601.物镜放大倍率

在需要大视场的应用中，显微镜物镜放大倍率应足以成像整个显微内窥镜探头顶端表面。例如典型10倍物镜的视场足以覆盖1毫米直径探头的整个孔径。整个光学系统的其他参数也需满足全孔径成像要求：单光子显微内窥术中相机芯片需足够宽；双光子显微内窥术中激光扫描范围需足够覆盖1毫米直径探头的整个端面。

0602.物镜数值孔径

为实现高分辨率成像，显微镜物镜的数值孔径应高于显微内窥镜探头中继透镜的数值孔径。在单光子成像中，这确保显微镜物镜能捕获探头中继透镜出射荧光的完整数值孔径，从而保持信号强度与图像分辨率。在双光子成像中，该条件确保激光照明充满探头物镜的后孔径，通常位于微物镜与中继透镜交界处，从而利用显微内窥镜物镜的全数值孔径将激光束聚焦于样本平面。但部分激光照明会损失，因为入射中继透镜的光束数值孔径高于中继透镜可接收的数值孔径。

0603.成像参数

单光子与双光子成像的详细参数可参阅《海马体活体显微内窥镜技术》一文。

三、结论

显微内窥镜技术是一种有效的手段，可扩展活体动物或人体中能够进行细胞水平成像的组织范围。显微内窥镜探头的设计可根据多样化的光学需求进行定制。总体而言，该技术为基础研究、动物疾病模型探索以及新疗法测试等领域开辟了广阔前景，使得对传统光学显微镜无法触及的脑区细胞进行成像成为可能。

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